产品货号：
YTB3939
中文名称：
生物素标记RNA探针检测试剂盒(ECL，EMSA)
英文名称：
Chemiluminescent RNA EMSA Kit
产品规格：
100T
发货周期：
1～3天
产品价格：
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本试剂盒是一种高效、灵敏的通过化学发光法检测生物素标记的RNA EMSA探针及其与蛋白质相互作用的试剂盒。本试剂盒采用了非特异性结合比Avidin更低的Streptavidin，使检测结果背景更低灵敏度更高。
EMSA是一种灵敏的技术，是基于DNA/RNA-蛋白复合物在聚丙烯酰胺凝胶电泳中有不同迁移率的原理，可用于鉴定蛋白质与核酸的相互作用。该技术提供了研究DNA或RNA结合蛋白和鉴定核酸底物的有效方法。在RNA EMSA实验中，末端标记的RNA探针与特定蛋白结合，形成RNA-蛋白复合物。经聚丙烯酰胺凝胶电泳，RNA-蛋白复合物的迁移速度比游离的RNA探针慢，可以观察明显的位移条带，即可判断RNA和蛋白的相互作用。传统的放射性EMSA技术程序繁琐，耗时较长，需要2～3天才能获得结果。本试剂盒为基于生物素标记探针的非放射性EMSA试剂盒(Biotin-EMSA)，采用了高灵敏度的化学发光技术，利用高质量的Streptavidin-HRP和BalbECL UT (一种极超敏的以luminol为基础的ECL类化学发光试剂)对生物素标记的RNA探针进行检测，轻松实现了RNA EMSA，实验时间大大缩短，约7～8个小时即可完成。
RNA结合蛋白(RNA binding proteins,RBPs)调控RNA的加工、成熟、运输、稳定性、翻译和降解，以促进细胞的生存和生长。研究RNA和蛋白的相互作用对正常的细胞功能和调节至关重要，而这种相互作用的检测通常需要使用放射性标记的RNA探针进行放射性EMSA或2D蛋白质凝胶电泳。
| 组分 | 规格 |
| REMSA Binding Buffer(10×) | 120μL |
| REMSA/Gel-Shift上样缓冲液(无色，10×) | 200μL |
| REMSA/Gel-Shift上样缓冲液(蓝色，10×) | 200μL |
| BalbECL UT A液 | 55mL |
| BalbECL UT B液 | 55mL |
| Streptavidin-HRP | 100μL |
| 封闭液 | 380mL |
| 洗涤液(5×) | 250mL |
| 检测平衡液 | 250mL |
| 生物素标记RNA阳性探针 | 30μL |
| 未标记RNA阳性探针 | 10μL |
| 阳性蛋白 | 20μL |
保存：-20℃，有效期1年。
- BalbECL UT A液、BalbECL UT B液、封闭液、洗涤液(5X)和检测平衡液可以4℃保存，至少一年有效。生物素标记RNA阳性探针和未标记RNA阳性探针最好能在-80℃保存。
- 操作过程要严格保证无RNase污染。请戴上口罩和手套操作，尽量防止人体表面的RNase污染样品。操作时应避免对着样品或所使用的试剂盒或耗材呼气或说话，以防RNase污染。对于操作环境中RNase的去除，推荐使用核酸酶喷雾清除剂以去除实验桌、仪器设备表面或其它接触面上的RNase。
- 所用试剂和耗材都要求是RNase-free，操作时应小心，避免被污染。如果耗材可能有RNase污染，可考虑用0.01%的DEPC水溶液浸泡过夜，然后高温高压灭菌并烘干。
- 蛋白样品制备过程中样品的稀释等都需使用无菌无酶超纯水或DEPC水。
- 初次实验时可使用试剂盒提供的阳性蛋白、生物素标记RNA阳性探针及未标记RNA阳性探针进行系统测试，确保实验体系正常。
- 需自备带正电荷尼龙膜，以及凝胶电泳时所需的相关试剂。带正电荷尼龙膜可以向我司订购。
- BalbECL UT A液和B液在吸取过程中必须要更换枪头，A液和B液相互污染后会导致A液或B液逐渐失效，影响后续的使用效果。
- 各溶液使用后，请盖紧瓶盖，以防失效。特别是BalbECL UT B液，含有氧化剂，比较容易被还原而失效。
- BalbECL UT A液和B液均对人体有害，操作时请小心，并注意有效防护以避免直接接触人体或吸入体内。
为验证整个化学发光法RNA EMSA实验条件和体系，本试剂盒提供了阳性对照系统，包含阳性蛋白、生物素标记RNA阳性探针、未标记RNA阳性探针。本试剂盒中的阳性探针与阳性蛋白能很好的结合，产生明显的位移带(Shift band)。使用本试剂盒对于阳性蛋白、HeLa细胞的细胞核蛋白和细胞浆蛋白的RNA EMSA效果参考图1。
图1.本试剂盒对阳性蛋白、HeLa细胞的细胞核蛋白和细胞浆蛋白的检测效果图。对于阳性蛋白及HeLa细胞的细胞核蛋白和细胞浆蛋白，包含阴性对照反应(样品1、4、8)、蛋白样本-RNA探针的结合反应(样品2、5、9)和未标记探针冷竞争反应(样品3、6、10)；对于HeLa细胞的细胞核蛋白和细胞浆蛋白，由于含有内源性Biotin标记的蛋白，同时设置了蛋白本身的对照(样品7、11)。对于含有内源性Biotin标记蛋白引起的条带(Endo biotin-protein band)，可以使用生物素检测封闭试剂盒降低内源性背景，但可能不会完全消除，若实验中目的蛋白较纯或者样品量较大，可缩短曝光时间以降低背景杂带。实际结果会因蛋白种类、纯度、电泳条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。
- 探针的制备：
本试剂盒只提供生物素标记RNA阳性探针和未标记RNA阳性探针，不提供RNA探针生物素标记的相关试剂。 - EMSA胶的配制：
用户可自备所需试剂，按照本步骤配制EMSA胶，也可直接购买BoGel EMSA PAGE预制胶(货号：YTC0185、YTC0186)。- 准备好倒胶的模具。可以使用常规的制备蛋白电泳胶的模具。最好选择可以灌制较薄胶的模具，以便于干胶等后续操作。为得到更好的结果，可以选择可灌制较大EMSA胶的模具。制胶前必须把制胶模具冲洗干净，需特别注意不能有SDS残留。
- 按照下表配制10mL 6%的聚丙烯酰胺凝胶。
成分 用量 推荐货号 5×TBE Buffer 1.0mL YT422/YTC0623 超纯水 6.6mL YT998/YT528 29:1 Acrylamide/Bisacrylamide (30%,w/v) 2mL YT623 80% Glycerol 312.5μL 10% Ammonium persulfate 75μL TEMED 10μL 总体积 10mL - - 按照上述顺序依次加入各种试剂，加入TEMED前先混匀，加入TEMED后立即混匀，并马上加入到制胶的模具中。避免产生气泡，并加上梳齿。如果发现非常容易形成气泡，可以把一块制胶的玻璃板进行硅烷化处理。
- 准备好倒胶的模具。可以使用常规的制备蛋白电泳胶的模具。最好选择可以灌制较薄胶的模具，以便于干胶等后续操作。为得到更好的结果，可以选择可灌制较大EMSA胶的模具。制胶前必须把制胶模具冲洗干净，需特别注意不能有SDS残留。
- EMSA结合反应：
- 按照下表设置EMSA结合反应。阴性对照组：仅含标记探针；探针冷竞争组：含样品蛋白、标记探针、标记探针400倍量的未标记探针；无探针样品组：含样品蛋白，用来排除样本蛋白是否存在自身的内源性Biotin。其中样品组也可以是阳性对照相应的试剂。
成分 阴性对照组 样品组 探针冷竞争组 无探针样品组 超纯水 8μL 7μL 6μL 8μL REMSA Binding Buffer(10×) 1μL 1μL 1μL 1μL Protein Extract - 1μL 1μL 1μL Unlabeled RNA probe - - 1μL - Biotin-labeled RNA probe 1μL 1μL 1μL - Total 10μL 10μL 10μL 10μL - 按照上表顺序依次加入各种试剂，在加入生物素标记好的RNA探针前先混匀。混匀之后先让未标记的RNA探针冰上先反应10分钟，以消除可能发生的探针和蛋白的非特异性结合。然后加入标记好的RNA探针，混匀，置于冰上反应10分钟。
- 混匀的时候不能大幅度振荡，轻轻混匀即可，全部操作都需在冰上进行。
- 试剂的加入顺序可能会影响RNA-蛋白复合体的特异性，请始终按照上表中列出的顺序添加结合反应组分。
- 对于进行supershift测试的情况，添加相应的目的蛋白的抗体，相应减少超纯水的添加量即可。
- 混匀的时候不能大幅度振荡，轻轻混匀即可，全部操作都需在冰上进行。
- 选做：不同蛋白样品的实验结果可能存在差异，通过添加其它成分如2M KCl、50% Glycerol、1M MgCl2、500mM DTT和tRNA/酵母RNA等，可以实现对测试系统的优化。KCl、MgCl2和DTT浓度增加可以增强结合反应，但过多的DTT会增加背景。添加Glycerol能够稳定蛋白质折叠，但过多的Glycerol会导致沿泳道边缘出现垂直条纹。tRNA/Yeast RNA是非特异性竞争性RNA，能够排除非特异性结合。测试每种试剂的效果需要分别建立反应，所涉及到的试剂可以向百奥莱博单独购买。
- 加入1μL REMSA/Gel-Shift上样缓冲液(无色，10×)，混匀后立即上样。
- 有时候溴酚蓝会影响蛋白和RNA的结合，建议尽量使用REMSA/Gel-Shift上样缓冲液(无色，10×)。如果对于使用REMSA/Gel-Shift上样缓冲液(无色，10×)在上样时感觉到无法上样，可以在REMSA/Gel-Shift上样缓冲液(无色，10×)里面添加极少量的REMSA/Gel-Shift上样缓冲液(蓝色，10×)，至可以观察到蓝颜色即可。
- 按照下表设置EMSA结合反应。阴性对照组：仅含标记探针；探针冷竞争组：含样品蛋白、标记探针、标记探针400倍量的未标记探针；无探针样品组：含样品蛋白，用来排除样本蛋白是否存在自身的内源性Biotin。其中样品组也可以是阳性对照相应的试剂。
- 电泳：
- 用0.5×TBE作为电泳液。按照10V/厘米的电压预电泳10分钟。
- 预电泳的时候如果有空余的上样孔，可以加入少量稀释好的1×的REMSA/Gel-Shift上样缓冲液(蓝色)，以观察电压是否正常进行。
- 把混合了上样缓冲液的样品加入到上样孔内。在多余的某个上样孔内加入10μL稀释好的1×的REMSA/Gel-Shift上样缓冲液(蓝色)，用于观察电泳进行的情况。
- 按照10V/厘米的电压电泳，电泳至REMSA/Gel-Shift上样缓冲液(蓝色)的蓝色染料溴酚蓝至胶的下缘1/4处，停止电泳。
- 如果温度升高，则会影响条带清晰度，为确保胶的温度不超过30℃，电泳的过程需在冰浴中进行。
- 用0.5×TBE作为电泳液。按照10V/厘米的电压预电泳10分钟。
- 转膜：
- 取一片和EMSA胶大小相近或略大的尼龙膜，剪角做好标记，用0.5×TBE浸泡至少10分钟。尼龙膜自始至终仅能使用镊子夹取，并且仅可夹取不可能接触样品的边角处。
- 取两片和尼龙膜大小相近或略大的滤纸，用0.5×TBE浸湿。
- 把浸泡过的尼龙膜放置在一片浸湿的滤纸上，注意避免尼龙膜和滤纸间产生气泡。
- 非常小心地取出EMSA胶放置到尼龙膜上，注意确保胶和膜之间没有气泡。
- 再把另外一片浸湿的滤纸放置到EMSA胶上，注意确保滤纸和胶之间没有气泡。
- 采用Western时所使用的湿法电转膜装置或其它类似的电转膜装置，以0.5×TBE为转膜液，把EMSA胶上的探针、蛋白以及探针和蛋白的复合物等转移到尼龙膜上。对于大小约为10×8×0.1cm的EMSA胶，用常用的Western转膜装置，电转时可以设置为360mA (约100V)转膜30～60分钟。如果胶较厚，则需适当延长转膜时间。转膜时需保持转膜液的温度较低，通常可以把电转槽置于4℃冷库或置于冰浴或冰水浴中进行电转，这样可以确保低温。具体的电转膜方法请参考电转膜装置的使用说明。
- 转膜完毕后，小心取出尼龙膜，样品面向上，放置在一干燥的滤纸上，轻轻吸掉下表面明显的液体。立即进入下一步的交联步骤，不可使膜干掉。
- 取一片和EMSA胶大小相近或略大的尼龙膜，剪角做好标记，用0.5×TBE浸泡至少10分钟。尼龙膜自始至终仅能使用镊子夹取，并且仅可夹取不可能接触样品的边角处。
- 交联：
- 用紫外交联仪选择254nm紫外波长，120mJ/cm2，交联45～60秒。如果没有紫外交联仪可以使用普通的手提式紫外灯，距离膜5-10厘米左右照射3～10分钟。也可以使用超净工作台内的紫外灯，距离膜5-10厘米左右照射3～15分钟。最佳的交联时间可以使用标准品自行摸索。
- 交联完毕后，可以直接进入下一步检测；也可以用保鲜膜包裹后在室温干燥处存放3～5天，然后再进入下一步检测。
- 如果检测结果发现交联效果不佳，甚至连Free probe的条带都非常微弱，可以考虑在膜干燥后参考步骤6a的条件再交联一次，以进一步改善交联效果。
- 用紫外交联仪选择254nm紫外波长，120mJ/cm2，交联45～60秒。如果没有紫外交联仪可以使用普通的手提式紫外灯，距离膜5-10厘米左右照射3～10分钟。也可以使用超净工作台内的紫外灯，距离膜5-10厘米左右照射3～15分钟。最佳的交联时间可以使用标准品自行摸索。
- 化学发光法检测生物素标记的探针：
- 37～50℃水浴溶解封闭液和洗涤液。
- 封闭液和洗涤液必须完全溶解后方可使用，封闭液和洗涤液可以在室温至50℃之间使用，但必须确保这两种溶液中均无沉淀产生，在冬天须特别注意。
- 取一合适的容器加入15mL封闭液，再放入交联过的含有样品的尼龙膜。在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动15分钟。
- 取6μL Streptavidin-HRP加入到6mL封闭液中(1:1000稀释)，混匀备用。
- 去除用于尼龙膜封闭的封闭液，加入上一步中配制的6mL含有Streptavidin-HRP的封闭液。在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动20分钟。
- 取25mL洗涤液(5×)，加入100mL ddH2O或Milli-Q级纯水，混匀配制成125mL洗涤液。
- 将尼龙膜转移至另一装有15～20mL洗涤液的容器内，漂洗1分钟。
- 去除洗涤液，加入15～20mL洗涤液，在侧摆摇床或水平摇床上缓慢洗涤5分钟。
- 重复步骤7g三次(共洗涤四次)，每次洗涤时间都约为5分钟。
- 将尼龙膜转移至另一装有20～25mL检测平衡液的容器内，在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动5分钟。
- 取5mL BalbECL UT A液和5mL BalbECL UT B液混匀，配制成10mL BalbECL UT工作液。
- BalbECL UT工作液必须现配现用。
- 从本步骤起操作方法和注意事项同Western实验的荧光检测。
- BalbECL UT工作液必须现配现用。
- 取出尼龙膜，用吸水纸吸去过多液体。立即将膜的样品面向上，放置到处于水平桌面上的洁净容器内或保鲜膜上。
- 在尼龙膜的表面小心加上步骤7J配制好的10mL BalbECL UT工作液，使工作液完全覆盖尼龙膜。室温放置2～3分钟。取出尼龙膜，用吸水纸吸去过多液体。将膜放在两片保鲜膜中间，随后进行压片检测或化学发光成像仪检测。
- 压片检测：将膜固定于片夹内。暗室内压片1分钟，立即显影定影，根据结果再调整压片时间。或直接分别压片0.5、1、3、5分钟，然后一起显影定影观察结果。
- 化学发光成像仪检测：将膜放置到化学发光成像仪内，参考仪器说明书进行检测，自动或手动曝光。使用本试剂盒对于阳性蛋白、HeLa细胞的细胞核蛋白和细胞浆蛋白的RNA EMSA效果参考图1。
- 37～50℃水浴溶解封闭液和洗涤液。
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